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DNA 编辑大师 CRISPR-Cas9,开创新时代的基因编修技术


2020-06-06


DNA 编辑大师 CRISPR/Cas9,开创新时代的基因编修技术

近几年生物医学蓬勃发展,让许多人期盼有一天科学家可以改变人类基因,达到治疗疾病或延长寿命的目的,但其实要改变生物原有的基因不是容易的事。首先我们得找到需要修改的基因,但是人类染色体含有 30 亿个硷基,要从中找到某个特定硷基来进行修改,比去中国找一个只知道名字却不知道下落的人还难上加难。

2012 年以前科学家进行基因或 DNA 编辑的工具主要有两种,一是 ZFN(Zinc Finger Nuclease);另一种是 TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)。这两者都是利用蛋白质来标定 DNA 的位置,然后利用 FokI 核酸酶剪断要编辑的基因,再进行插入或移除。不过 ZFN 和 TALEN 用来辨识 DNA 位置的蛋白质都不容易製作,而且 ZFN 对细胞有毒性,TALEN 则因分子大不易高效导入,因此科学家往往要费九牛二虎之力才能编辑一个基因。这些困难要等到 CRISPR / Cas 出现才得以解决。

DNA 编辑大师 CRISPR/Cas9,开创新时代的基因编修技术 此为去氧核醣核酸片段结构动画,各种硷基水平排列于两条螺旋长链之间。漫长的发现过程

如果说 Photoshop 是相片编辑大师,那幺 CRISPR / Cas 系统就堪称是 DNA 编辑大师了。

CRISPR / Cas 包含两个部份,第一个是 CRISPR(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats),这是一段排列奇特的 DNA;第二个是 Cas,是一种核酸酶。这两者组合起来就成为一套 DNA 编辑系统。这套系统的发现非常有趣,最初是 1987 年日本科学家 Y. Ishino 等人在大肠桿菌的 iap 基发现一段奇怪的 DNA,这段 DNA 是由两个单元 repeat 和 spacer 不断重複组成,当时他们不明白这段 DNA 有什幺意思,把它取了个名字叫 CRISPR。到了 2002 年,科学家发现 CRISPR 经常和 cas 基因连在一起,因此把这一段 DNA 合称 CRISPR / Cas。

2005 年 C. Pourcel 发现 CRISPR 中的 spacer 来自曾攻击细菌的病毒。两年后 R. Barrangou 终于解开了这段 DNA 的谜:原来 CRISPR / Cas 系统是细菌抵抗病毒攻击的一套免疫系统。当病毒攻击细菌后,如果细菌没死,便会把病毒遗留下来的 DNA 片段加到自己的 CRISPR 成为一段 spacer,所以如果一只细菌曾遭受 10 次不同病毒攻击,便会增加 10 个 spacer。等到下一次再遭受病毒攻击时,细菌的 CRISPR / Cas 便会比对病毒的 DNA 序列,如果和某个 spacer 一模一样,那就表示这只病毒曾经来犯过,Cas 核酸酶便会将这个病毒的 DNA 剪断,使病毒失去攻击细菌的能力。

到底 CRISPR 如何比对病毒 DNA 呢?2008 年 S.J.J. Brouns发现细菌原来是由 CRISPR 转录的一段特别 RNA 来比对病毒 DNA 序列,这段 RNA 称作 crRNA。事实上 CRISPR 除了使用 crRNA 来比对外,有时还需要另一段特别的 RNA (tracrRNA)来辅助寻找病毒 DNA。目前知道 CRISPR / Cas 系统可以粗略分成三大类:Type I、II、III。其中 Type I、III 只需要 crRNA 就可以找到病毒 DNA;而 Type II 则需要 crRNA 和 tracrRNA 合作才能找到。不过 Type I、III 如果要切断病毒的 DNA,需要 8 种 Cas;而 Type II 只需要一种(Cas9)即可,因此 type II 的 CRISPR / Cas9 受到科学家的青睐全力发展。

 3 种 DNA 编辑工具比较

DNA 编辑大师 CRISPR/Cas9,开创新时代的基因编修技术

CRISPR / Cas9的功能

如果把 DNA 编辑技术与半导体发展做对照,ZFN 的技术层次就像是真空管,TALEN 则是电晶体,而 CRISPR / Cas9 就迈入积体电路时代,因此 CRISPR / Cas9 可称为近年生物学界的最大突破。

2012 年可说是 CRISPR / Cas9 系统大丰收的一年。I. Yosef 发现病毒 DNA 上有一段特别的区域叫 PAM,可以被 crRNA 用来加强辨识 DNA 位置。美国加大柏克莱分校的蒋内可(M. Jinek)把 crRNA 和 tracrRNA 黏起来,变成一条合成的单股RNA,称 sgRNA,大幅简化製作 CRISPR / Cas9 的过程,同年他又提出修改 sgRNA 裁切其他 DNA 的方法。瑞典Umeå 大学的夏虹缇(E. Charpentier)和美国加大柏克莱分校的杜德娜(J. Doudna)正式提出了 CRISPR / Cas9 这套可程式化的细菌免疫系统。2013 年哈佛-麻省理工博德研究所(Broad Institute)的合成生物学家张锋(Feng Zhang),将这套系统用于哺乳动物多个基因(multiplex)的编修,并获得成功。

张锋的研究非常重要,因为以往的 ZFN 和 TALEN 有个大缺点,只能在每次实验中改变一个基因,但是动物的表现型大多由多个基因所控制,例如人类的身高、肤色以及大部份的疾病,对于这些需求,ZFN 和 TALEN 毫无用武之地,而 CRISPR / Cas9 系统则没有这个限制,因此能够大幅放宽应用範围。

CRISPR / Cas9 价格便宜、操作简单,一般实验室几乎都能依照指示展开实验,自 2012 年后相关的研究如雨后春笋冒出,据统计 2013 年有 277 篇科学研究;2014 年有 587 篇;2015 年预计会有 1,100 篇以上的论文。可以预见诺贝尔奖将会颁发给发现这套系统的相关研究者。

CRISPR / Cas9 也牵涉到庞大的经济利益,无数的新药开发和疾病治疗都牵涉到 DNA 的编辑,据估计相关的商机有几百亿美元。基于上述种种因素,各方人马无不尽力要证明自己是 CRISPR / Cas9 的第一位发现者,其中竞争最激烈的就是杜德娜和张锋的团队。

挑起专利诉讼和诺贝尔奖的争夺战火

2014 年 4 月美国专利商标局发给张锋第一个 CRISPR 的专利,这项专利涵盖了所有真核细胞,也就是除了细菌以外的所有生物。这消息让杜德娜和夏虹缇非常不满,因为她们比张锋早了 7 个月申请 CRISPR 专利,却迟迟得不到回应。为什幺张锋后申请却先得到回覆?这其中有两个关键原因。

第一、原来美国专利商标局有一种加速专利申请的方法叫 track one,一般专利申请审核都会超过 12 个月,但是使用 track one 则保证 6 个月内给答案。当然天下没有白吃的午餐,使用 track one 必须缴交很多钱。张锋的团队有个哈佛大学富爸爸,替他们付了这笔钱。

第二、由论文发表的时间点来看,杜德娜和夏虹缇是 2012 年 6 月发表于 Science,而张锋则等到 2013 年 1 月才发表在同杂誌,明显杜德娜才是首创。的确以现在美国专利商标局的规定「first to file」的人,即杜德娜和夏虹缇才能获得专利;但是张锋申请专利时美国用的是旧规定,即「first to invent」的人获得专利,也就是只要你能证明自己是第一个想到的人就可以获得专利。张锋在专利申请书上附上了 2012 年初的实验室笔记──早于杜德娜的 6 月──证明自己早就有这个想法。

现在张锋和杜德娜两人势同水火,大战才刚拉开序幕。杜德娜在张锋获得专利后,马上退出她与张锋共同成立的 Editas 公司,转投敌营 Intellia。杜德娜在 YouTube 亲自录製影片介绍 CRISPR / Cas9;张锋则做了一个网站 addgene 推广他们 lab 的 CRISPR plasmids。今年 4 月杜德娜背后的加州大学,要求专利商标局撤销张锋代表的哈佛-麻省理工博德研究所 10 项有关 CRISPR / Cas9 的专利。据估计这场专利大战没有 3、5 年是不会落幕的。

医疗潜力无穷尽

不管张锋和杜德娜之争结果如何,CRISPR / Cas9 将会带给人类巨大的改变。最新的研究显示可以用这套系统将人类 T 细胞一种表面抗原 CXCR4 去除,如此一来,爱滋病毒 HIV 便无法感染 T 细胞;此外也成功地运用这种技术,治癒患有裘馨氏肌肉萎缩症的老鼠。虽然现在 CRISPR / Cas9 使用在人类身上还有许多技术问题需要克服,如效率太低、马赛克效应(mosaic effect)、脱靶效应(off-target effect)等,各国法规和伦理也有诸多限制,不过假以时日这些问题终将被一一解决,届时圣经创世纪第一章「神就照着自己的形象造人」可能要被改写成「人就照着自己的想像造完美的人」。



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